兔脂肪干细胞的多向诱导分化

doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2012.49.008

中国组织工程研究 ›› 2012, Vol. 16 ›› Issue (49): 9162-9167.doi: 10.3969/j.issn.2095-4344.2012.49.008

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兔脂肪干细胞的多向诱导分化

王清富，陈庄洪，蔡贤华，谢永辉，刁波，刘琴

解放军广州军区武汉总医院骨科，湖北省武汉市 430070

收稿日期:2012-06-01 修回日期:2012-10-25 出版日期:2012-12-02 发布日期:2012-10-25
通讯作者: 陈庄洪，教授，主任医师，博士生导师，解放军广州军区武汉总医院骨科，湖北省武汉市 430070
作者简介:王清富☆，男，1977年生，广东省化州市人，汉族，在读博士，主要从事脊柱外科、骨组织工程研究。 frandis@126.com
基金资助:
全军“十一五攻关”项目助资(06G047)。

Multi-directional induced differentiation of rabbit adipose-derived stem cells

Wang Qing-fu , Chen Zhuang-hong, Cai Xian-hua, Xie Yong-hui, Diao Bo, Liu Qin

Department of Orthopedics, Wuhan General Hospital of Guangzhou Military Command, Wuhan 430070, Hubei Province, China

Received:2012-06-01 Revised:2012-10-25 Online:2012-12-02 Published:2012-10-25
Contact: Chen Zhuang-hong, Professor, Chief physician, Doctoral supervisor Department of Orthopedics, Wuhan General Hospital of Guangzhou Military Command, Wuhan 430070, Hubei Province, China
About author:Wang Qing-fu☆, Studying for doctorate, Department of Orthopedics, Wuhan General Hospital of Guangzhou Military Command, Wuhan 430070, Hubei Province, China
Supported by:
Supported by: “Eleventh Five-Year” Project of PLA , No. 06G047*

摘要/Abstract

摘要：

背景：研究表明脂肪干细胞体外特定诱导条件下实现了向骨、软骨、脂肪、肌肉、心肌细胞、神经细胞、上皮细胞以及肝细胞方向分化。
目的：进一步验证脂肪干细胞的分离培养方法及其基本生物学特性，并对细胞表型进行鉴定。
方法：从成年日本大耳白兔的颈背部分离脂肪组织，通过Ⅰ型胶原酶消化法获取原代脂肪干细胞并培养，待细胞生长至约80%融合时传代，用倒置显微镜逐日观察细胞生长情况和形态特征，描绘其生长曲线；流式细胞技术检测细胞表面标记物；将脂肪干细胞行成骨和成脂诱导，分别通过碱性磷酸酶、茜素红、VonKossa(钙结节)染色和油红O染色检测脂肪干细胞成骨分化潜能和成脂分化潜能，以未诱导细胞作为对照组。
结果与结论：体外培养的脂肪干细胞呈梭形纤维样细胞形态，增殖活跃，多次传代后细胞仍保持较强增殖能力，生长曲线呈“S”型。流式细胞仪检测第3，6代脂肪干细胞均高表达CD29、CD44，阳性率超过90%；低表达 CD34、CD45阳性率不超过5%，且CD29、CD44 随着传代表达逐渐增高，CD34、CD45随细胞培养时间延长表达逐渐降低。成骨诱导实验组碱性磷酸酶、茜素红、vonKossa染色阳性，成脂诱导实验组油红O染色阳性，对照组均为阴性。结果证实，兔脂肪干细胞在体外易于分离培养，保持稳定增殖，并表达间充质干细胞相关的表型，特定条件下可诱导分化为成骨细胞和脂肪细胞。

关键词: 脂肪干细胞, 干细胞, 细胞培养, 鉴定, 诱导分化, 成骨诱导, 成脂诱导, CD29, CD44, CD34, CD45

Abstract:

BACKGROUND: Studies have shown that adipose-derived stem cells can be induced to differentiate into osteoblasts, chondrocytes, myocardial cells, neurons, epithelial cells and hepatocytes under certain conditions.
OBJECTIVE: To investigate the isolation and culture method and the basic biological characteristics of adipose-derived stem cells in order to identify its cell phenotype.
METHODS: Adipose tissue was collected from the neck and back of adult Japanese white rabbits, and the primary adipose-derived stem cells were obtained and cultured with type Ⅰ collagenase and when the cells grow to cover about 80% of the space, the growth situation and morphological characteristics of adipose-derived stem cells were observed with inverted microscope every day, and the growth curve was drawn; cell surface markers were checked by flow cytometry; the adipose-derived stem cells were induced to osteogenesis and adipogenesis respectively, the osteogenic differentiation potential and adipogenic differentiation potential were assessed through the alkaline phosphatase, alizarin red, VonKossa (calcium nodules) staining and oil red O staining of adipose-derived stem cells, control group was non-induced.
RESULTS AND CONCLUSION: Adipose-derived stem cells cultured in vitro exhibited a spindle-shaped appearance and actively proliferated. After subculture, adipose-derived stem cells were strongly proliferated and their growth curve was “S” shaped. Passages 3 and 6 adipose-derived stem cells highly expressed CD29 and CD44 as detected by flow cytometry, with a positive rate of more than 90% and lowly expressed CD34 and CD45 with a positive rate of less than 5%; and the expression of CD29 and CD44 was gradually increased while the expression of CD34 and CD45 was gradually decreased with the passage increased. Alkaline phosphatase, alizarin red and von Kossa staining were positive in the osteogenic-induction group and oil red O staining was positive in the adipogenic-induction group, whilethese staining were negative in the control group. Rabbit adipose-derived stem cells could be easily isolated and cultured, and stably proliferated, and they expressed mesenchymal stem cells-related phenotype and could be induced to differentiate into osteoblasts and adipocytes under certain conditions.

中图分类号:

R394.2

王清富，陈庄洪，蔡贤华，谢永辉，刁波，刘琴. 兔脂肪干细胞的多向诱导分化[J]. 中国组织工程研究, 2012, 16(49): 9162-9167.

Wang Qing-fu,Chen Zhuang-hong, Cai Xian-hua, Xie Yong-hui, Diao Bo, Liu Qin. Multi-directional induced differentiation of rabbit adipose-derived stem cells[J]. Chinese Journal of Tissue Engineering Research, 2012, 16(49): 9162-9167.

图/表（结果） 5

2.1 细胞形态学观察原代细胞接种后两三个小时开始贴壁，初为圆形、椭圆形，细胞大小不等，12 h后可见部分细胞开始伸展为短梭形、三角形，24 h大部分细胞贴壁。细胞在最初三四天处于潜伏期，生长较缓慢，然后细胞进入增殖期，细胞开始形成团簇状增生灶，长梭形纤维样细胞数量明显增多，细胞逐渐彼此相连，铺满瓶底，长梭形、三角形细胞多见。7-9 d原代脂肪干细胞可达80%左右融合，见图1。传代细胞增殖速度较原代快，四五天可长至 80%融合。传代后细胞形态为长梭形，多次传代后，细胞形态基本保持不变，增殖旺盛，见图2。

Figure 1 Morphology of parimary cultured adipose-derived stem cells (×100)

图1 原代培养的兔脂肪干细胞形态(×100) 注：传代后细胞形态为长梭形，多次传代后，细胞形态基本保持不变 Figure 2 Morphology of the passaged rabbit adipose-derived stem cells (×100)

图2 传代培养的兔脂肪干细胞形态 (×100)

2.2 传代细胞增殖能力用CCK-8法检测第3，7，10代细胞增殖能力。结果显示：传代培养的脂肪干细胞最初一两天细胞潜伏期逐渐向增殖期过渡，第4天进入对数生长期，随着时间增加而增殖，第7天进入平台期，细胞生长曲线呈“S”形，第3，7，10代细胞的生长曲线类似，见图3。

注：细胞生长曲线呈“S”形

Figure 3 Growth curve of passages 3, 7 and 10 adipose-derived stem cells

图 3 第3，7，10代脂肪干细胞生长曲线

2.3 细胞周期取3代细胞经过流式细胞仪检测结果显示：G₁期细胞占绝大多数，达到87.16%，S期为 6.23%，这说明细胞正向增殖期过渡，处于活跃状态。 2.4 脂肪干细胞表型鉴定流式细胞仪检测提示，第3，6代脂肪干细胞均高表达间充质干细胞的相关标志物CD29、CD44，阳性率超过90%；低表达造血干细胞相关标志物CD34和血细胞相关标志物CD45，阳性率超过5%，且CD29、CD44随着传代表达逐渐增高，CD34、CD45随细胞传代表达逐渐降低。见图4。

注：第3代脂肪干细胞高表达CD29、CD44，低表达CD34和CD45 Figure 4 Cell genotype of passage 3 adipose-derived stem cells detected by flow cytometry

图 4 流式细胞仪检测第3代脂肪干细胞表型

2.5 脂肪干细胞的成脂诱导结果脂肪干细胞更换成脂诱导培养液后细胞增殖缓慢，诱导后5 d胞浆内出现少量脂滴并逐渐聚集，细胞形态亦明显变化，逐渐由长梭形变为多边形、椭圆形或不规则。2周时出现了大量的脂滴，见图5a，随着诱导时间的延长，脂滴逐渐增多增大，3周时油红O染色阳性，细胞内出现大量红染颗粒，见图5b，对照组脂肪干细胞无明显变化。证实脂肪干细胞可被诱导向脂肪分化，见图5c

注：第3代脂肪干细胞高表达CD29、CD44，低表达CD34和CD45

Figure 4 Cell genotype of passage 3 adipose-derived stem cells detected by flow cytometry

图 4 流式细胞仪检测第3代脂肪干细胞表型

2.6 脂肪干细胞的成骨诱导结果见图6。诱导脂肪干细胞更换成骨诱导培养液后细胞增殖稍慢，诱导后3- 5 d后，可见细胞形态逐渐改变，由长梭形变为类圆形、多边形或不规则形，并且体积有所增大；1周后细胞开始呈簇状生长，2周时细胞团逐渐增大。

2周后碱性磷酸酶染色阳性，可见胞浆内出现蓝色沉淀，见图6a，对照组细胞颜色及形态无明显改变仍呈成纤维细胞样外观，碱性磷酸酶染色为阴性，见图6b； Vonkossa染色见钙结节呈黑色，即Vonkossa染色阳性，见图6c。3周茜素红染色见钙结节呈桔红色，即茜素红染色阳性，见图6d；对照组均为阴性，见图6e。

Figure 6 Osteogenic induction of adipose-derived stem cells (×100)

图6 脂肪干细胞的成骨诱导结果(×100)

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引言

材料方法

设计：细胞体外形态学观察与鉴定。

时间及地点：于2011年8至12月在解放军广州军区武汉总医院医学实验科完成。

材料：健康成年日本大耳白兔5只，体质量2.5- 3.5 kg，雌雄不限，由解放军广州军区武汉总医院医学实验科提供，实验过程中对动物的处置符合赫尔辛基宣言动物伦理学标准^[2]。

实验方法：

脂肪干细胞的分离和培养：以速眠新(0.2-0.3 mL/kg)对日本大耳白兔行肌注麻醉后，备皮、消毒、铺巾，取颈后部正中切口长约5 cm，无菌切取皮下脂肪组织，清除肉眼可见的小血管，尽可能去除包膜及结缔组织后用PBS清洗3-5次以去除红细胞。用眼科剪剪碎呈糜状，加入2倍体积0.1%Ⅰ型胶原酶，置于37 ℃恒温摇床振荡消化，持续60 min，加入等量含体积分数为10%胎牛血清的DMEM/F12终止消化，200目筛网过滤，1 000 r/min离心(离心半径13 cm)10 min，去上清，加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12重悬浮细胞，用吸管轻柔吹打，接种于25 cm²培养瓶中。置于37 ℃、体积分数为5%CO₂饱和湿度恒温培养箱静置培养。2 d后首次更换培养液，弃去未贴壁细胞，以后每3 d换液1次，倒置显微镜下逐日观察细胞形态及生长情况，待细胞生长融合达80%左右时，去除培养液，加入适量2.5 g/L胰蛋白酶- EDTA消化液消化，按1∶3进行传代培养。

细胞形态学观察：使用倒置显微镜观察原代及传代细胞形态、生长及增殖情况进行连续观察、摄像。

CCK8法检测细胞体外增殖能力：取第3，7，10代兔脂肪干细胞以1×10⁷ L^-¹的细胞浓度接种96孔培养板内，每孔200 μL，加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12，于37 ℃、体积分数5%CO₂条件下培养。从次日起至贴壁细胞在培养孔底部融合为止，每日取3个孔进行计数。加入CCK8 10 μL/孔，37 ℃孵育4 h，然后在450 nm处检测其吸光度，取3孔吸光度的均值，以时间(d)为横坐标，吸收值(A)为纵坐标，绘制生长曲线。

细胞周期的测定：取第5代细胞，细胞密度约1×10⁷，用2.5 g/L的胰蛋白酶消化，以1 000 r/min(离心半径 13 cm)，离心5 min，体积分数10%甲醛4 ℃下固定 24 h，PBS洗涤2遍，离心后加入50 mg/L的碘化丙啶(PI)避光静置染色30 min，流式细胞仪检测细胞周期。

流式细胞术检测脂肪干细胞表面标记：取第3，6代脂肪干细胞，胰蛋白酶消化，离心1 000 r/min(离心半径13 cm) ×5 min，弃上清，PBS洗涤1次，加少量PBS吹打均匀，调整细胞浓度为1×10¹⁰ L^-¹，将细胞悬液分装入5个Ependorf管(100 μL/管)，其中的4管分别加入荧光标记的兔抗单克隆抗体CD29，CD34，CD44，CD45抗体 20 μL，以不加抗体做为对照，避光孵育30 min，最后用体积分数10%甲醛固定细胞，流式细胞仪检测。

脂肪干细胞成脂诱导：取第3代脂肪干细胞，胰蛋白酶消化后以1×10⁸/cm²的浓度接种于6孔板中，用含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12培养液培养24 h后更换为诱导培养液。成脂诱导培养基为^[3]：含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12，0.5 mmol/L IBMX(3-异丁基- 1-甲基黄嘌呤)，1 μmol/L 地塞米松，10 μmol/L胰岛素，200 μmol/L吲哚美辛；对照组加常规培养基，三四天换1次液。油红O染色：成脂诱导3周的脂肪干细胞用100 g/L多聚甲醛在4 ℃条件下固定1 h，70%异丙醇清洗，加2%油红室温下8 min，异丙醇洗去多余的染料，PBS漂洗3遍，显微镜下观察。

脂肪干细胞成骨诱导：取第3代脂肪干细胞，胰蛋白酶消化后以1×10⁸/cm²的浓度接种于6孔板中，用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养液培养24 h后更换为诱导培养液。成骨诱导培养基为^[3]：含体积分数10%胎牛血清的DMEM/F12，0.1 μmol/L地塞米松，50 μmol/L抗坏血酸，10 mmol/L β-甘油磷酸钠；对照组加常规培养基，两三天换1次液。成骨诱导后碱性磷酸酶检测：脂肪干细胞诱导培养2周时采用碱性磷酸酶染色试剂盒法进行碱性磷酸酶染色；钙结节染色：脂肪干细胞诱导培养3周时进行茜素红染色和Vonkossa染色。

主要观察指标：①兔脂肪干细胞体外原代及传代细胞形态。②兔脂肪干细胞的生长曲线及倍增时间。③兔脂肪干细胞表型及细胞周期。④兔脂肪干细胞成骨和成脂诱导结果。

讨论

自从2001年Zuk等^[1]从人体抽脂术中抽取的脂肪组织悬液中第1次分离获得具有多向分化潜能的干细胞，即脂肪干细胞以来，脂肪干细胞的研究成为继骨髓干细胞之后又一热点。研究表明脂肪干细胞体外特定诱导条件下实现了向骨、软骨、脂肪、肌肉、心肌细胞、神经细胞、上皮细胞以及肝细胞方向分化^[3-8]。脂肪干细胞以其自体来源、容易获取、细胞充足、多向分化、基因稳定表达、自体移植无免疫排斥反应、不涉及医学伦理学问题等特点可能成为组织工程理想的种子细胞^[9]。因此有必要对其广泛深入的研究。

3.1 脂肪干细胞的分离与培养目前国内外众多文献报道中，脂肪干细胞的分离培养方法尚没有公认规范统一的标准。由于成熟脂肪基质中含有大量Ⅰ型胶原，为使基质细胞和脂肪基质纤维成分分离，大多数文献选用Ⅰ型胶原酶消化分离原代细胞，但也有使用Ⅱ型胶原酶^[10]，或联合应用胰酶^[11]，甚至仅用胰酶进行消化分离的报道^[12]。所用的Ⅰ型胶原酶浓度从0.75-2.5 g/L不等，消化时间从30 min-3 h差异很大^[13-14]。

实验最初采用Zuk等^[3]使用过的Ⅰ型胶原酶浓度 0.75 g/L，但未能取得预期的效果。不同种属实验对象的脂肪组织是否对消化酶浓度的要求有差别需要进一步研究。经过摸索，使用浓度为1 g/L的Ⅰ型胶原酶震荡消化，使脂肪组织和消化液充分混合，提高了消化效率，在较短的时间内取得了满意的消化效果，细胞获取量大，收集的原代活细胞多，且分离方法简便可靠，可操作性和可重复性强。

在细胞形态方面，原代脂肪干细胞形态不一，表现为圆形、椭圆形或短梭形，能够贴壁生长，传代培养后逐渐转变长梭形，形态较为均一，融合时可见旋涡状生长。CCK-8检测显示本实验培养的第3，7，10代兔脂肪干细胞的生长曲线均近似S形，符合正常干细胞的生长规律^[15]。在体外培养条件下的脂肪干细胞生长经历了生长滞缓期、对数增殖期和生长平台期，说明脂肪干细胞在一定阶段内增殖十分活跃。CCK-8检测结果显示第3代细胞增殖能力最强，传至第7代时仍保持较为强劲的增殖，第10代后细胞增殖稍有下降，这与Safford等^[16]的实验结果相近。因此提示体外培养扩增10代以内的脂肪干细胞可作为组织工程种子细胞。

3.2 脂肪干细胞的表型特征国内外学者对脂肪干细胞的表型进行了全面深入的研究，迄今为止尚无研究发现脂肪干细胞有特异性的细胞表型。尽管不同的研究小组得出有所不同，但一般认为CD29，CD44，CD90，CD105是具有多向分化潜能细胞的标记分子，在脂肪干细胞鉴定中均可检出阳性表达，而白细胞标记CD45表达为阴性，争议之一在于脂肪干细胞是否表达内皮细胞标记CD106和造血干细胞标记CD34，Gronthos等^[17]研究发现脂肪干细胞表达CD34和CD106，而Zuk等^[3]的研究结果与之相反。这些不同的结果可能是由实验室的条件不同或者细胞的分离方法不同、检测的细胞代次及状态不同、对免疫织组化学和流式细胞仪的敏感度差异等原因所致的。

实验挑选很具有鉴别意义的细胞标记CD29，CD34，CD44，CD45作为脂肪干细胞的鉴定。流式细胞仪检测显示第3、6代脂肪干细胞均高表达CD29、CD44，阳性率超过90%；低表达 CD34、CD45阳性率不超过5%，且CD29、CD44 随着传代表达逐渐增高， CD34、CD45随细胞培养时间延长表达逐渐降低。这与Gronthos等^[17]研究结果相近。目前，通过常规的胶消化分离脂肪组织获得的的多能性干细胞，其实是混合细胞群，主要为脂肪干细胞，往往同时存在少量的造血细胞、内皮细胞、平滑肌细胞和周细胞；随着不断传代，这些混杂的非间质干细胞类型细胞将逐渐消失，尤其是造血细胞和内皮细胞。

3.3 脂肪干细胞的多向诱导分化由于目前尚未发现脂肪干细胞有特异性的细胞表型，流式细胞仪检测的结果对鉴定脂肪干细胞只有辅助作用，并没有决定意义。脂肪干细胞的鉴定目前多采用表面标志物和多向诱导分化相结合的方法来证实其干细胞特性因此鉴定。故实验采用成脂、成骨诱导分化对培养细胞的干细胞特性进行进一步观察。成脂诱导3周时油红O染色阳性，细胞内出现大量红染颗粒，对照组脂肪干细胞无明显变化。证实脂肪干细胞可被诱导向脂肪分化。分泌钙盐是成骨细胞的特征之一，茜素红染色是特异的钙盐染色方法。成骨诱导后的脂肪干细胞茜素红染色阳性，证实脂肪干细胞已经向成骨细胞分化。同时另一个成骨细胞的特异性标志物，碱性磷酸酶染色也呈阳性表达，进一步证实脂肪干细胞具有向成骨细胞分化的能力。这与文献[18]报道的结果基本一致。

总之，脂肪干细胞含量丰富、来源广泛、取材简便、创伤小、体外扩增速度快、扩增稳定，有望成为组织工程种子细胞的更为理想的选择。同时也必须看到通过目前方法获得的细胞并非纯的脂肪干细胞，而是多种细胞的混合群体，混杂了内皮细胞、造血细胞等，可能会对其在实际应用时组织构建带来不利的影响，因此，如何进一步纯化组织来源的干细胞是组织工程面临的一个关键问题。

兔脂肪干细胞的多向诱导分化

Multi-directional induced differentiation of rabbit adipose-derived stem cells

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